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單克隆抗體制備方法，趕快保存下來

單克隆抗體是由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤

單克隆抗體是人工制備的雜交瘤細胞生物試劑的，雜交瘤細胞是由一個經(jīng)抗原激活后的B細胞與一個骨髓瘤細胞融合形成。單克隆抗體優(yōu)點：純度高，靈敏度高，特異性強，交叉反應少，制備的成本低。缺點：對技術有一定的要求，而且通過抗原的化學處理很容易丟失表位

原理：
B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體。這種技術即稱為單克隆抗體技術。過程

1）免疫脾細胞的制備 制備單克隆抗體的動物多采用純系 Balb/c小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方法同一般血清的制備，也可采用脾內(nèi)直接免疫法。

2）骨髓瘤細胞的培養(yǎng)與篩選 在融合前，骨髓瘤細胞應經(jīng)過含8-AG的培養(yǎng)基篩選，防止細胞發(fā)生突變恢復HGPRT的活性（恢復HGPRT的活性的細胞不能在含8-AG的培養(yǎng)基中存活）。骨髓瘤細胞用10%小牛血清的培養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，融合前24h換液一次，使骨髓瘤細胞處于對數(shù)生。

3）細胞融合的關鍵:
1技術上的誤差常常導致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應答。這必然要失敗的。
2融合試驗失敗原因是污染，融合成功的關鍵是提供一個干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術。

4）陽性克隆的篩選 應盡早進行。通常在融合后10天作di一次檢測，過早容易出現(xiàn)假陽性。檢測方法應靈敏、準確、而且簡便快速。具體應用的方法應根據(jù)抗原的性質(zhì)，以及所需單克隆抗體的功能進行選擇。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫熒光法等。其中ELISA法簡便，RIA法準確。陽性克隆的篩選應進行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。

5）克隆化 克隆化的目的是為了獲得單一細胞系的群體?？寺』瘧M早進行并反復篩選。這是因為初期的雜交瘤細胞是不穩(wěn)定的，有丟失染色體的傾向。反復克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細胞株?？寺』姆椒ê芏?，而常用的是有限稀釋法。
（1）顯微操作法：在顯微鏡下取單細胞，然后進行單細胞培養(yǎng)。這種方法操作復雜，效率低，故不常用。
（2）有限稀釋法：將對數(shù)生的雜交瘤細胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個細胞接種在培養(yǎng)皿中，細胞增值后成為單克隆細胞系?？寺』瘯r加一定量的飼養(yǎng)細胞。由于克隆化生長的細胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩(wěn)定的單克隆細胞株需經(jīng)2～3次的再克隆才成。應該注意的是，每次克隆化過程中所有有意義的細胞都應冷凍保存，以便重復檢查，避免丟失有意義的細胞。
（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養(yǎng)的目的。但此法不如有限稀釋法好。
（4）熒光激光細胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標記雜交瘤細胞，然后根據(jù)抗原與雜交瘤細胞結(jié)合的特異性選出細胞，并進行單細胞培養(yǎng)。

6）細胞的凍存與復蘇

7）大規(guī)模單克隆抗體的制備 選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備，因為融合細胞隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備，一般應用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。